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龙血竭提取物对正常及四氧嘧啶糖尿病模型小鼠的影响

作者:刘培培, 雍克岚, 吕敬慈, 栾梅, 张天宝

【关键词】 龙血竭提取物;,,四氧嘧啶;,,血糖;,,胰岛素;,,血清

  摘要:目的研究了龙血竭提取物对正常及四氧嘧啶糖尿病模型小鼠的影响。方法采用正常小鼠和四氧嘧啶糖尿病模型小鼠,用葡萄糖氧化酶法测定血糖,用放射免疫法测血清胰岛素,用高效液相色谱(HPLC)分析小鼠的血清。结果龙血竭提取物对正常小鼠空腹血糖无明显降低作用,能降低四氧嘧啶糖尿病模型小鼠的空腹血糖水平,能改善小鼠对蔗糖的耐受力,增加正常小鼠的胰岛素分泌,血清样本中有药物成分检出。结论龙血竭提取物对糖尿病小鼠有较好的治疗作用,可升高血清胰岛素水平,其部分组分能够被动物体内吸收并进入血液发挥作用。

  关键词:龙血竭提取物; 四氧嘧啶; 血糖; 胰岛素; 血清

  Glucosedecreasing Effect of Extract from Resina Draconis on Mice

  Abstract:ObjectiveTo study the effect of extract from on mice. MethodsNormal mice and alloxaninduced diabetic mice were used. Blood glucose was measured with glucose oxidase method, and insulin was measured with radioimmunoassay, and the serum in mice was analyzed by HPLC. ResultsResina Draconis had no obvious effects of decreasing the serum glucose level in normal mice, but could decrease the serum glucose level in alloxaninduced diabetic mice. Also, Resina Draconis improved the sucroseresistance in normal mice and diabetic mice and increased insulin in normal mice. Some of components of Resina Draconis had been measured in serum sample. ConclusionResina Draconis exerts have a good therapeutic effect on alloxaninduced diabetic mice and its mechanism may be related to the increasing of the secretion of insulin and the absorbing of some of the components of Resina Draconis in vivo.

  Key words:Resina Draconis; Alloxan; Blood glucose; Insulin; Serum

  血竭(Resina Draconis)是中药的传统品种之一,被誉为“活血之圣药”的珍贵中药,血竭其味甘、咸;性温、平;归心、肝经;兼有活血化淤,消肿止痛,止血补血之功效[1,2]。现代医学研究证明,血竭具有改善机体微循环,调整新陈代谢,改善免疫功能等作用。具有明显的抗细菌、抗真菌、抗氧化、抑制血小板凝集、抗血栓、增强纤溶等活性[3]。近年来有研究表明血竭全粉亦具有治疗糖尿病的功效[4],但其有效部位在治疗糖尿病方面的研究尚无报道,其降糖机制亦不明确。本实验室以龙血竭为原料经过超临界萃取以及丙酮抽提得到龙血竭的降糖有效部位,观察了龙血竭提取物对正常小鼠以及四氧嘧啶糖尿病模型小鼠的血糖、血清、血清胰岛素的影响,并对其作用机制进行初步探讨。

  1 器材

  1.1 龙血竭提取物(Resina Draconis, ERD)龙血竭(广西中医学院)先采用超临界CO2萃取(萃取条件:萃取压力为15 mp,萃取温度为40℃,萃取时间为2 h,CO2流量30 kg/h),收集萃取残余物作为活性成分的粗提物,自制一个抽提循环回流装置,将活性成分的粗提物装入回流装置的浸出器中,加入数倍量的丙酮溶液,在一定的条件下,抽提数小时,回收抽提液溶剂并浓缩至干。临用前用生理盐水配成所需浓度。

  1.2 动物昆明种小鼠,体重20~25 g,雄性,购自上海复旦医学院动物实验中心,合格证号:SCXK沪20020002。

  1.3 试剂和仪器四氧嘧啶(alloxan),Fluca产品;葡萄糖氧化酶,购自上海维思公司;过氧化物酶,购自中国医药集团上海化学试剂公司;叠氮钠,浙江城关化工厂产品;胰岛素放射免疫分析药盒,中国生物技术集团公司产品;拜糖苹(Acarbose),拜耳公司产品;糖适平(格列喹酮, gliquidone), 德国勃林格殷格翰国际公司产品;其余试剂均为市售分析纯。紫外分光光度计,日本岛津UV260;高速台式离心机TGL16G,上海安亭科学仪器厂;超临界流体萃取装置(HA2205006型),南通市华安超临界萃取有限公司; Aglient 1100,安捷伦科技有限公司。

  2 方法与结果

  2.1 ERD对正常小鼠血糖水平的影响 取50只昆明种小鼠,随机分成5组,每组10只,即ERD3个剂量组(100,300,500 mg/kg),阳性对照组(Acarbose,20 mg/kg)及阴性对照组(Control,生理盐水)。均按0.10 ml/10 g体积灌胃给药,1次/d,连续7 d,末次给药前禁食8 h,给药2 h后眼眶静脉窦采血,分离血清按葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖[5],所得数据进行组间t检验。由表1可见,ERD各剂量组动物空腹血糖水平稍有降低,但与对照组比较无显著差异。这表明血竭提取物各剂量组对正常小鼠血糖无明显影响,有利于开发成为降糖中药制。

  2.2 ERD对正常小鼠糖耐量的影响60只小鼠随机分为5组,每组12只,即ERD 3个剂量组(100,300,500 mg/kg),阳性对照组(Acarbose,20 mg/kg)及阴性对照组(Control,生理盐水)。灌胃给药,1次/d,连续7 d,末次给药前禁食8 h,给药2 h后眼眶静脉窦采血,然后灌胃给蔗糖(2.5 g/kg),测定给蔗糖后0.5,1,2 h的血糖值。血糖测定方法同上,所得数据进行组间t检验。由表2可见, ERD高剂量组在1,2 h时有显著的降血糖作用(P<0.01),ERD中剂量组在1,2 h时有明显的降血糖作用(P<0.05)。其效果均优于Acarbose。

  表1 龙血竭提取物对正常小鼠空腹血糖的影响(略)

  2.3 ERD对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖的影响取100只正常昆明小鼠禁食14 h后,腹腔注射2%四氧嘧啶生理盐水溶液,注射72 h后眼眶静脉窦采血,测定空腹血糖(取血前禁食10 h)方法同前。选取血糖高于11.1 mmol・L-1的为糖尿病模型小鼠,根据血糖水平将糖尿病模型鼠随机分为5组,每组10只,分别为模型对照组(Model),ERD3个剂量组(500,300,100 mg/kg),模型对照组灌胃生理盐水,阳性对照组(Acorbose,20 mg/kg),给药方法均同前,连续给药10 d。在末次给药前8 h禁食,给药2 h后眼眶静脉窦取血。血糖测定方法同前,所得数据进行组间t检验。由表3可见,与糖尿病模型组比较,ERD低剂量能够明显降低血糖(P<0.05), ERD中、高剂量组都能显著降低四氧嘧啶模型小鼠的血糖(P<0.01),与对照组Acarbose具相似降糖效果。
2.4 龙血竭提取物对四氧嘧啶糖尿病小鼠糖耐量实验取昆明种小鼠100只禁食14 h,造模方法以及血糖测定方法同前。取模型小鼠随机分为5组,每组10只,分别为模型对照组(Model),ERD3个剂量组(500,300,100 mg/kg),阳性对照组(Acorbose,20 mg/kg),模型对照组灌胃生理盐水,给药方法均同前,连续给药7 d。在末次给药前8 h禁食,给药2 h后眼眶静脉窦采血,然后蔗糖(2.5 g/kg)灌胃,测定给蔗糖后0.5,1,2 h的血糖值。血糖测定方法同上,所得数据进行组间t检验。结果见表4。由表4可知,四氧嘧啶糖尿病模型小鼠的葡萄糖耐量在1 h达高峰,2 h后下降;3组给药组小鼠血糖在2 h时均比模型组血糖有了明显降低(P<0.01)。其中ERD高、中剂量组在1 h时有明显的降血糖作用(P<0.01),效果优于Acarbose。

  表2 龙血竭提取物对正常小鼠糖耐量的影响(略)

  与阴性对照组比较,*P<0.05 ,**P<0.01;n=12

  表3 龙血竭提取物对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠血糖值的影响(略)

  与模型组比较,*P<0.05 ,**P<0.01

  2.5 ERD对正常小鼠血清胰岛素的影响取75只正常昆明小鼠随机分为5组,每组15只,即血竭提取物3个剂量组(100,300,500 mg/kg),阳性对照组(糖适平,12 mg/kg)及阴性对照组(Control,生理盐水)。灌胃给药,2次/d,连续14 d,末次给药前禁食8 h,给药1 h后眼眶静脉窦取血,分离血清得供试样品,用放射免疫分析法测定胰岛素(INS)[6],所得数据进行组间t检验。结果见表5,ERD中剂量和高剂量能显著增加小鼠血清胰岛素的含量,与对照组有显著性比较差异(P<0.01),促胰岛素分泌效果与糖适平相近。ERD低剂量也能明显增加小鼠血清胰岛素的含量(P<0.05)。

  表4 龙血竭提取物对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的糖耐量实验(略)

  与模型对照组比较,*P<0.05, **P<0.01

  表5 龙血竭提取物(EDB)对正常小鼠血清胰岛素的影响(略)

  与阴性对照组比较,*P<0.05 ,**P<0.01

  2.6 ERD对正常及四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血清的影响取上述正常及四氧嘧啶糖尿病模型小鼠若干,随机分组,即正常小鼠空白血清组、正常小鼠给药血清组、四氧嘧啶糖尿病模型空白血清组和给药血清组,200 mg/mlERD悬浊液,灌胃给药,给药1 h后取血,分离血清,甲醇沉淀蛋白,离心取上清液,Aglient 1100进行分析,分析条件:Zorbax XDBC18,9.4 mm×250 mm,进样量10 μl,流动相:甲醇:乙腈:0.05 mol/L KH2PO4缓冲液=5∶30∶65,流速:1 ml/min。结果见图1~4。通过比较,由下图可知无论是正常小鼠还是四氧嘧啶糖尿病模型小鼠,空白血清和给药以后分离的血清,它们的HPLC图谱均有所不同,给药组出峰比空白组出峰多,其中最为明显的是,给药组均在约17 min的位置上有出峰位置,而在空白血清组的图谱中却没有,此外给药组还有其他出峰位置,这些亦是空白组血清中所没有的,这说明ERD能够被动物体内吸收,进入血液发挥作用。

  图1 正常小鼠空白血清(略)

  图2 正常小鼠给药组血清(略)

  图3 四氧嘧啶糖尿病模型小鼠空白血清(略)

  图4 四氧嘧啶糖尿病模型小鼠给药组血清(略)

  3 讨论

  实验结果表明ERD能够降低四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖水平,增加正常及四氧嘧啶糖尿病模型小鼠对蔗糖的耐受能力,实验过程中还观察到ERD能够改善糖尿病小鼠多饮、多尿等状况,对糖尿病小鼠有较好的治疗作用,降血糖作用和剂量相关。另外,ERD对正常动物血糖影响较小,有利于今后开发成为低毒的降糖中药制剂。在利用高效液相色谱分析正常和糖尿病模型小鼠的血清的过程中,发现给药后,在小鼠血清中检出若干组分,这些组分是空白小鼠血清中所没有的,这说明ERD能够被动物体内吸收并发挥其降糖作用,这些组分到底是什么物质还有待于进一步的深入研究,此外,ERD还能够促进正常小鼠胰岛素的分泌,这些都可能和ERD降血糖作用的机理有关,为ERD降糖机理的进一步研究奠定了一定的实验基础。

 

 

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