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石菖蒲提取物及其初步分离物的抑菌活性
邓业成, 玉艳珍, 王萌萌, 张明, 骆海玉, 覃旭, 李丽芬
(广西师范大学 生命科学学院; 药用资源化学与药物分子工程教育部重点实验室, 广西 桂林 541004)
 摘要:采用滤纸片法和带药培养基涂布法测定了中药植物石菖蒲茎和叶甲醇提取物对13种动物病原菌的抑菌活性。结果表明,用带药培养基涂布法测定,石菖蒲茎提取物对表皮葡萄球菌、藤黄微球菌、溶壁微球菌、蜡样芽孢杆菌、痢疾志贺氏菌、伤寒杆菌、巨大芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌9种供试菌有较好的抑菌作用,其最低抑制浓度(MIC值)分别为1.5 g/L2.5 g/L3.5 g/L2.0 g/L1.5 g/L2.5 g/L2.5 g/L3.5 g/L2.5 g/L,对变形杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和白色念珠菌4种病原菌在样品浓度为10 g/L时没有抑菌活性石菖蒲叶提取物的抑菌活性较差,在浓度为10 g/L时,对痢疾志贺氏菌和蜡样芽孢杆菌在72小时有抑菌活性,对其余供试菌没有抑菌活性。用滤纸片法测定,结果与用带药培养基涂布法基本一致,但抑菌圈较小。采用液-液萃取法对石菖蒲茎提取物的抑菌活性成分进行了初步分离,生测结果表明,1 g/L浓度处理72h正丁醇萃取物9种供试病原菌有抑菌作用,石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和水萃取物没有抑菌作用,说明石菖蒲的抑菌活性物质主要存在于正丁醇萃取物中。
关键词:石菖蒲;病原菌;抑菌活性;活性物质
 
石菖蒲(Acorus tatarinowii Schott.)为天南星科多年生草本植物,分布于中国黄河以南各省区,印度和泰国等国也有分布。石菖蒲是中国传统的常用中药,全株有芳香气,其味辛、苦,性温,具有镇静和抗惊厥[1-3]、益智 [3-5]及对心血管系统的调节作用 [6-7]。临床广泛用于治疗健忘、中风失语、耳呜、老年性痴呆等疑难病症,其水提液对治疗老年痴呆有较好的疗效[8]。石菖蒲的化学成分复杂多样,目前从石菖蒲中分离鉴定出的化学成分主要有单贴类、倍半贴类、二贴类、苯丙素类等挥发油成分及黄酮类、生物碱、糖类、有机酸、氨基酸等非挥发性成分。Chunhui Deng等[9]采用气-质联用技术从石菖蒲精油中分离鉴定出32种化学成分;陶宏等[10]和杨晓燕等[11]从石菖蒲的水提取物中共分离出16个化合物。此外,石菖蒲在农药领域也有多种生物活性和用途。何衍彪等[12]发现石菖蒲提取物对芒果炭疽病菌和香蕉尖孢镰刀菌有抑制作用;Soon-Okim[13-14]等人研究发现石菖蒲挥发油对米象、绿豆象和烟草甲三种储粮害虫表现出很强的抑制活性;姚英娟等[15]发现石菖蒲提取物对玉米象有驱避、__________________________
基金项目:药用资源化学与药物分子工程教育部重点实验室资助项目(桂科能07109001-11);广西自然科学基金资助项目(桂科自0991097);广西环境工程与保护评价重点实验室资助项目(桂科能0702K026)
作者简介:邓业成(1965-),广西全州人,广西师范大学教授,博士。主要从事天然产物研究。
触杀和种群抑制作用;谢红英等[16]报道石菖蒲提取物对粘虫幼虫有拒食、毒杀和生长发育抑制作用。可见石菖蒲的生物活性和用途相当广泛。但是到目前为止,石菖蒲对动物病原菌的抗菌活性尚未有研究和报道。本研究旨在明确石菖蒲对动物病原菌的抗菌活性,为该植物的综合开发利用提供依据。
   
1 材料与方法
1.1 供试菌种
    表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis,大肠杆菌Escherichia coli(Migula)Casleillii and Chalmers,藤黄微球菌Micrococcus luteus,绿脓杆菌Pesudomonas aeruginosa(Schroeter) Migula,溶壁微球菌Micrococcus lysodeikticus Fleming,变形杆菌Proteus vulgaris Hauser,蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus Frankland,痢疾志贺氏菌Shigella dysenteriae(Shiga) Castellani and Chalmers,伤寒杆菌Salmonella typhi(Schroeter) Warren and Scott,巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium de Bary,金黄色葡萄球菌Staphyloccocus aureus Rosenbach,枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(Ehrenberg) Cohn,白色念珠菌Monilia albican。上述供试菌由桂林医学院提供,并用牛肉膏蛋白胨培养基或沙氏培养基进行扩菌后于4℃保存备用。
1.2 供试植物
    石菖蒲(Acorus tatarinowii Schott.):为天南星科(Araceae)菖蒲属(Acorus)植物,从桂北地区采集。
1.3 试验方法
1.3.1石菖蒲提取物的制备
    植物材料的提取采用溶剂冷浸法。将采集的石菖蒲茎和叶洗净泥土和杂质,放在室内通风处晾干,再在60℃恒温鼓风干燥箱中烘干至发脆,用植物粉碎机粉碎。称取一定质量的干粉,放入锥形瓶中,加5倍量的甲醇溶剂,在室温下浸提48 h(其间每隔12 h振摇一次),抽滤。重复2次,将2次滤液合并,用旋转蒸发仪在水浴中减压浓缩,蒸干溶剂得膏状提取物。称重,密封保存于4℃冰箱中备用。
1.3.2石菖蒲茎甲醇提取物活性物质的初步分离
石菖蒲茎提取物活性物质的初步分离采用液-液萃取法。称取提取物7g溶于100 mL蒸馏水中,装入500 mL分液漏斗,依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取。每种溶剂萃取3次,合并3次萃取液,减压浓缩,分别获得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物。对各萃取物进行抑菌活性测定,根据抑菌活性大小确定活性物质存在的部位。
1.3.3滤纸片法测定石菖蒲提取物的抑菌活性
参照慕立义的方法[17]并加以改进。先将定性滤纸用直径为7 mm的打孔器打成小圆片,高压蒸汽灭菌后,放入浓度为10 g/L的样品液中浸泡1分钟,取出晾干备用。取10 mL牛肉膏蛋白胨培养基加到9 cm培养皿中制成培养基平板,取菌悬液0.1 mL加到培养基表面,用涂布器涂布均匀。然后在培养基表面贴上4片浸药滤纸片和1片未浸药滤纸片,每处理重复3个培养皿。盖好皿盖,置37℃恒温培养箱中培养24 h,测定并记录抑菌圈直径,并计算平均值。
1.3.4用带药培养基涂布法测定抑菌活性及最小抑菌浓度MIC
参照慕立义的方法[17]并加以改进。用丙酮和无菌水(1∶1)组成的混合溶剂溶解提取物,配成100 g/L的药液。在超净工作台上取1 mL药液(对照用混合溶剂代替药液)与9 mL 牛肉膏蛋白胨热培养基混匀,倒入直径为9 cm的玻璃培养皿中,制成厚薄均匀的带药培养基。取菌悬液0.1 mL加到培养基表面,用涂布器涂布均匀,置37℃恒温培养箱中培养。每处理重复3个皿。培养一定时间后观察记录菌落的生长情况。测定最小抑菌浓度时,制备系列浓度的带药培养基,接菌培养,不长菌的最低浓度即为最小抑菌浓度(MIC)。
 
结果分析
2.1 石菖蒲茎和叶甲醇提取物对13种人和动物病原菌的抑菌活性
分别用滤纸片法和带药培养基涂布法测定了石菖蒲茎和叶甲醇提取物对13种人和动物病原菌抑菌活性,结果见表1和表2。用滤纸片法测定,当样品浓度为10 g/L时,石菖蒲叶提取物对藤黄微球菌、蜡样芽孢杆菌和痢疾志贺氏菌有抑菌作用,但抑菌圈小,对其余供试菌无抑菌活性;石菖蒲茎提取物除了对大肠杆菌和绿脓杆菌无抑菌作用外,对其余11种供试菌均有不同程度的抑菌活性,对溶壁微球菌、变形杆菌、蜡样芽孢杆菌、痢疾志贺氏菌和白色念珠菌的抑菌圈相对较大,平均值为0.9 0-1.00 cm,对其他供试菌的抑菌圈较小。
用带药培养基涂布法测定,石菖蒲叶提取物在10 g/L时抑菌活性差,除了对痢疾志贺氏菌和蜡样芽孢杆菌在72小时有抑菌活性,对其余供试菌无抑菌活性;石菖蒲茎提取物对表皮葡萄球菌、藤黄微球菌、溶壁微球菌、蜡样芽孢杆菌、痢疾志贺氏菌、伤寒杆菌、巨大芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌9种供试菌均有较好的抑菌作用,其MIC值分别为1.5 g/L、2.5 g/L、3.5 g/L、2.0 g/L、1.5 g/L、2.5 g/L、2.5 g/L、3.5 g/L和2.5 g/L,对变形杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和白色念珠菌在浓度为10 g/L时没有抑菌作用。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
表1 石菖蒲茎和叶甲醇提取物对13种人和动物病原菌的抑菌活性(滤纸片法)
供试病原菌
抑菌圈直径(cm)
表皮葡萄球菌
0.81
0
大肠杆菌
0
0
藤黄微球菌
0.80
0.79
绿脓杆菌
0
0
溶壁微球菌
0.95
0
变形杆菌
0.90
0
蜡样芽孢杆菌
0.94
0.80
痢疾志贺氏菌
0.87
0.80
伤寒杆菌
0.77
0
巨大芽孢杆菌
0.82
0
金黄色葡萄球菌
0.76
0
枯草芽孢杆菌
0.83
0
白色念珠菌
1.00
0
   
表2 石菖蒲茎和叶甲醇提取物对13种人和动物病原菌的抑菌活性(带药培养基涂布法)
供试病原菌
样品质量浓度(g/L)
10
10
5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1.0
表皮葡萄球菌
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大肠杆菌
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藤黄微球菌
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绿脓杆菌
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溶壁微球菌
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变形杆菌
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蜡样芽孢杆菌
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痢疾志贺氏菌
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伤寒杆菌
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巨大芽孢杆菌
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金黄色葡萄球菌
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枯草芽孢杆菌
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白色念珠菌
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注:“-”代表不长菌,“+”代表长菌,每个浓度重复3次。
2.2 石菖蒲茎提取物不同萃取物的抑菌活性
采用液-液萃取法对石菖蒲茎甲醇提取物进行活性成分初步分离,得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物4个部分。采用带药培养基涂布法测定了各萃取物对9种较敏感的人和动物病原菌的抑菌活性,结果见表3。由表可知,当各萃取物浓度为1 g/L时,正丁醇萃取物对9种病原菌72 h都有抑菌活性;石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物在24 h对大多数病原菌有抑菌活性,48 h没有抑菌活性;水层没有抑菌活性。说明石菖蒲的抑菌活性成分主要存在正丁醇萃取物中。
表3 石菖蒲茎提取物的各萃取物对9种病原菌的抑菌活性
菌种
石油醚萃取物
乙酸乙酯萃取物
正丁醇萃取物
水层萃取物
24h
48h
72h
24h
48h
72h
24h
48h
72h
24h
48h
72h
表皮葡萄球菌
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++
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藤黄微球菌
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溶壁微球菌
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蜡样芽孢杆菌
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痢疾志贺氏菌
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伤寒杆菌
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巨大芽孢杆菌
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金黄色葡萄球菌
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枯草芽孢杆菌
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注:样品浓度为1g/L;“-”表示不长菌,“+”表示长菌,每个处理重复3次。
 
讨论
本研究发现,中药植物石菖蒲对多种动物病原菌有抑菌活性,表明其作为抗菌中药有很好的发展前景。植株不同部位的抑菌活性不同,茎的抑菌活性高,叶的抑菌活性低。长期以来都是以石菖蒲茎作为药材使用,说明茎是主要的药效部位。石菖蒲对不同的病原菌抑菌活性也不同,对革兰氏阳性细菌活性好,对革兰氏阴性菌活性差,如在测定的13种病原菌中,有7种阳性细菌,1种阳性真菌,5种阴性细菌,石菖蒲茎提取物对7种阳性细菌都有较高活性,在5种阴性菌中只对2种阴性细菌有活性,对另外3种阴性细菌和1种阳性真菌在提取物浓度为10 g/L时无活性。这可能与病原菌细胞壁的特性有关,不同细菌胞壁的结构和化学特性不同,从而影响了活性物质进入细胞内部。
采用液-液萃取法对石菖蒲提取物进行了初步分离,分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇对提取物的水溶液依次萃取,获得4部分萃取物,活性测定表明,活性部分为正丁醇萃取物,说明石菖蒲的抑菌活性物质主要存在于正丁醇萃取物中。根据相似相溶原理,活性成分可能是极性较高的化学物质。对其抑菌活性物质的分离纯化和结构鉴定有待进一步研究。本文首次报道了石菖蒲对动物病原菌的抑制活性,这对促进其综合开发利用有十分重要的意义。
  
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Inhibitory activity of traditional Chinese drug plant Acorus tatarinowii Schott. against pathogens of animals
Deng Ye-cheng, Yu Yan-zhen, Wang Meng-meng, Zhang Ming, Luo Hai-yu, Qin Xu, Li Li-feng
(College of Life Science, Guangxi Normal University; Key Laboratory for the Chemistry and Molecular Engineering of Medicinal Resources, Ministry of Educationof China, Guilin 541004, China)
Abstract: The inhibitory activity of the methanol extracts from stems and leaves of traditional Chinese drug plant Acorus tatarinowii Schott. against 13 pathogens of animals was determined using filter paper disk method and culture medium coating method. The results determined by culture medium coating method showed that the extract from the stems had inhibitory activity against Staphylococcus epidermidis, Micrococcus luteus, Micrococcus lysodeikticus1.5 g/L, 2.5 g/L, 3.5 g/L, 2.0 g/L, 1.5 g/L, 2.5 g/L, 2.5 g/L, 3.5 g/L and 2.5 g/L, respectively, and had no inhibitory activity against Proteus vulgaris, Escherichia coli, Pesudomonas aeruginosa and Monilia albican at 10 g/L;, Bacillus cereus, Shigella dysenteriae, Salmonella typhi, Bacillus megaterium, Staphyloccocus aureus and Bacillus subtilis, with the MIC values of extract from leaves exhibited inhibitory activity only against Shigella dysenteriae and Bacillus cereus at 10 g/L after 72 h, and no inhibitory activity against other tested pathogens. The results determined by filter paper disk method was approximately consistent with that determined by culture medium coating method, but the inhibition zone was small. The active ingredients of extract from stems of Acorus tatarinowii Schott. were preliminarily isolated by liquid-liquid extraction, and the inhibitory activity of the isolated petroleum ether extract, ethyl acetate extract, n-butyl alcohol extract and water extract against pathogens was determined. The results indicated that n-butyl alcohol extract had inhibitory activity against the 9 tested pathogens at 1 g/L after 72 h, and other extracts showed no activity, suggesting that the active ingredients of Acorus tatarinowii Schott. mainly exist in n-butyl alcohol extract.
Key words: Acorus tatarinowii Schott.; pathogens; inhibitory activity; active ingredients
 
 

 

 

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